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实时荧光定量PCR基础知识

2017-10-22 19:50:39 由 lzy5151 发表 126

DNA聚合酶

PCR 的性能通常与热稳定性DNA 聚合酶有关,因此酶的选择是反应成功的关键。影响PCR 特异性的一个主要因素是 TaqDNA 聚合酶在低温下具有残留活性。在反应的设置中,引物可与DNA 非特异性地退火结合,使得聚合酶合成非特异性产物。


通过采用“热启动”酶,可最大程度地减少因引物错配形成非特异性产物的问题。采用热启动酶确保了在反应设置过程和初始DNA 变性步骤中,DNA 聚合酶无活性。


逆转录酶

逆转录酶(RT) 同DNA聚合酶一样,亦是 qRT-PCR 成功的关键。选择一种不仅能够提供高全长cDNA 产量且在高温下具有良好活性的RT 至关重要。


高温性能对于具有二级结构的RNA 的变性同样极为重要。在一步法qRT-PCR中,可在较高温度下维持活性的RT 使您能够使用具有高熔解温度(Tm) 的GSP,提高了特异性,降低了背景。


最好从同一供应商那里购买dNTP 和热稳定性DNA 聚合酶,因为在实验中使用不同供应商的试剂,常常会出现阈值循环(Ct) 灵敏度下降的情况。



镁离子浓度

在实时荧光定量PCR 中,氯化镁或硫酸镁的终浓度一般为3 mM。这是大多数靶点的最佳工作浓度;但镁离子的最佳浓度范围为3 至6 mM。


好的实验技术

不要低估良好的实验技术的重要性。反应的每个阶段 (从模板制备到PCR 后分析)最好使用专门的设备和解决方案。使用防气溶胶吸头和螺帽管有助于减少交叉污染问题。



要获得严格的重复数据(理论上为三次重复),需制备包含除样本外的所有反应组分的预混液。使用预混液可减少加样步骤,从而降低孔间污染及其它加样误差的几率。


模板

每次实时荧光定量PCR 反应需使用10 至1,000 拷贝的模板核酸。这相当于大约100 pg 至 1 μg 的基因组DNA 或利用1 pg至100 ng 总 RNA 生成的cDNA。多余的模板也可能提高污染物含量,大大降低 PCR 效率。


PCR 引物的特异性针对 cDNA而非基因组DNA,处理RNA 模板以降低其包含基因组DNA 污染的几率十分重要。一种方案是采用 DNA酶I 处理模板。


纯的完整RNA 是高质量全长cDNA 合成的基础,也是实现准确的 mRNA 定量的关键。RNA 应避免RNA 酶污染,且应维持无菌状态。总RNA 一般适用于qRT-PCR;通常无需mRNA 提取,但提取 mRNA 可提高特定 cDNA 的产量。


实时荧光定量PCR 引物设计

良好的引物设计是实时荧光定量PCR 的最重要参数之一。这正是众多研究人员选择购买TaqMan®Assay 产品的原因——这些引物和探针采用了成熟可靠的算法设计,获得了全世界科学家的信赖,适用于实时荧光定量PCR。


如果您选择设计您自己的实时荧光定量PCR 引物,切记扩增片段的长度应约为50–150 bp,因为较长的产物无法实现高效扩增。


一般而言,引物的长度应为18–24 个寡核苷酸。这是针对实际的退火温度的。引物应根据标准PCR 指南设计。它们对于目的基因序列应是特异性的,且无内部二级结构。


引物应不含共聚物延伸段序列(如 poly (dG)) 或重复基序,因其可引起不必要的杂交。引物对应具有相当的熔解温度(在 1°C 以内),且GC 含量约为50%。高GC 含量的引物可形成稳定的不良杂合体。


相反,高AT 含量会降低匹配良好的杂合体的 Tm值。如果可能,引物的 3’端应具有高GC 含量(GC 夹),以提升延伸端的退火效率。分析引物对序列,避免引物之间的互补和杂交(引物二聚体)。


在qRT-PCR 中,设计内含子两侧可与外显子退火结合的引物 (或覆盖mRNA 相邻两个外显子交界处),利用熔解曲线分析区分cDNA 和潜在污染基因组DNA 的扩增。要确认引物的特异性,可在公共数据库上进行 BLAST 搜索,以确保您的引物只识别目的靶点。


想获得最佳结果,需要在50 至500 nM 浓度间进行引物滴定。引物终浓度为200 nM时能有效地进行大多数的实验。


引物设计软件

引物设计软件程序 (如OligoPerfect™ 设计工具和Primer Express®软件) 及序列分析软件(如Vector NTI®软件) 可自动评估目的序列,并根据上述标准设计序列引物。


使用引物设计软件至少可以确保引物针对目的序列的特异性,且不会形成内部二级结构,并能避免每条引物的 3’端自身或与其它引物之间形成互补杂交。如前所述,在使用DNA 结合染料进行扩增片段检测时,良好的引物设计尤为关键。


基线

实时荧光定量 PCR 反应的基线是指在PCR的最初几个循环中 (一般为第3 至15 个循环)的信号水平,此阶段的荧光信号变化极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声” 。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析,根据经验确定。应仔细设置基线,以准确确定阈值循环(Ct) (定义如下)。基线确定应考虑足够的循环数,消除扩增早期的背景,但应排除扩增信号开始超过背景的循环。当比较不同的实时荧光定量PCR 反应或实验时,应采用同样的方法确定基线


实时荧光定量 PCR 反应的基线和阈值


阈值

实时荧光定量 PCR 反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加。设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。实时荧光定量PCR 仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10 倍。但阈值可设置在PCR指数期的任意点。


Ct(阈值循环)

阈值循环(Ct) 是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。Ct值可用于计算起始 DNA 拷贝数,因为Ct 值与起始靶点量呈反比。例如,比较含有不同靶点量的样本的实时荧光定量PCR 结果时,如果第一个样本扩增前起始的靶基因拷贝数是后一个样本的两倍,较之第二个样本,第一个样本可提早一个循环生成Ct。前提是上述两个反应的PCR 的工作效率均为100% (即每个循环后产物量均实现倍增)。模板量越低,出现明显扩增的循环数越高。模板按 10倍稀释,则 Ct 值递减 3.3 个循环。


10 倍连续稀释的扩增曲线


标准曲线

利用连续稀释的已知样本建立标准曲线,确定实验样本的目的模板起始量,或者评估反应效率。以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标(x轴),该浓度对应的Ct 值为纵坐标(y轴),绘制曲线。从该标准曲线中可以推导出反应性能及各种反应参数 (包括斜率、y 截距和相关系数)相关的信息。标准曲线中所选的浓度应涵盖实验样本的预期靶点浓度范围。

 

实时荧光定量 PCR 数据的标准曲线示例。标准曲线的 y 轴表示阈值循环 (Ct),x 轴表示起始 RNA 或 DNA 靶点量。斜率、y-截距和相关系数值可用于提供反应性能相关的信息。