实时荧光定量PCR基础知识

DNA聚合酶

PCR 的性能通常与热稳定性DNA 聚合酶有关，因此酶的选择是反应成功的关键。影响PCR 特异性的一个主要因素是 TaqDNA 聚合酶在低温下具有残留活性。在反应的设置中，引物可与DNA 非特异性地退火结合，使得聚合酶合成非特异性产物。

通过采用“热启动”酶，可最大程度地减少因引物错配形成非特异性产物的问题。采用热启动酶确保了在反应设置过程和初始DNA 变性步骤中，DNA 聚合酶无活性。

逆转录酶(RT) 同DNA聚合酶一样，亦是 qRT-PCR 成功的关键。选择一种不仅能够提供高全长cDNA 产量且在高温下具有良好活性的RT 至关重要。

高温性能对于具有二级结构的RNA 的变性同样极为重要。在一步法qRT-PCR中，可在较高温度下维持活性的RT 使您能够使用具有高熔解温度(Tm) 的GSP，提高了特异性，降低了背景。

最好从同一供应商那里购买dNTP 和热稳定性DNA 聚合酶，因为在实验中使用不同供应商的试剂，常常会出现阈值循环(Ct) 灵敏度下降的情况。

在实时荧光定量PCR 中，氯化镁或硫酸镁的终浓度一般为3 mM。这是大多数靶点的最佳工作浓度；但镁离子的最佳浓度范围为3 至6 mM。

不要低估良好的实验技术的重要性。反应的每个阶段 (从模板制备到PCR 后分析)最好使用专门的设备和解决方案。使用防气溶胶吸头和螺帽管有助于减少交叉污染问题。

要获得严格的重复数据(理论上为三次重复)，需制备包含除样本外的所有反应组分的预混液。使用预混液可减少加样步骤，从而降低孔间污染及其它加样误差的几率。

每次实时荧光定量PCR 反应需使用10 至1,000 拷贝的模板核酸。这相当于大约100 pg 至 1 μg 的基因组DNA 或利用1 pg至100 ng 总 RNA 生成的cDNA。多余的模板也可能提高污染物含量，大大降低 PCR 效率。

PCR 引物的特异性针对 cDNA而非基因组DNA，处理RNA 模板以降低其包含基因组DNA 污染的几率十分重要。一种方案是采用 DNA酶I 处理模板。

纯的完整RNA 是高质量全长cDNA 合成的基础，也是实现准确的 mRNA 定量的关键。RNA 应避免RNA 酶污染，且应维持无菌状态。总RNA 一般适用于qRT-PCR；通常无需mRNA 提取，但提取 mRNA 可提高特定 cDNA 的产量。

良好的引物设计是实时荧光定量PCR 的最重要参数之一。这正是众多研究人员选择购买TaqMan®Assay 产品的原因——这些引物和探针采用了成熟可靠的算法设计，获得了全世界科学家的信赖，适用于实时荧光定量PCR。

如果您选择设计您自己的实时荧光定量PCR 引物，切记扩增片段的长度应约为50–150 bp，因为较长的产物无法实现高效扩增。

一般而言，引物的长度应为18–24 个寡核苷酸。这是针对实际的退火温度的。引物应根据标准PCR 指南设计。它们对于目的基因序列应是特异性的，且无内部二级结构。

引物应不含共聚物延伸段序列(如 poly (dG)) 或重复基序，因其可引起不必要的杂交。引物对应具有相当的熔解温度(在 1°C 以内)，且GC 含量约为50%。高GC 含量的引物可形成稳定的不良杂合体。

相反，高AT 含量会降低匹配良好的杂合体的 Tm值。如果可能，引物的 3’端应具有高GC 含量(GC 夹)，以提升延伸端的退火效率。分析引物对序列，避免引物之间的互补和杂交(引物二聚体)。

在qRT-PCR 中，设计内含子两侧可与外显子退火结合的引物 (或覆盖mRNA 相邻两个外显子交界处)，利用熔解曲线分析区分cDNA 和潜在污染基因组DNA 的扩增。要确认引物的特异性，可在公共数据库上进行 BLAST 搜索，以确保您的引物只识别目的靶点。

想获得最佳结果，需要在50 至500 nM 浓度间进行引物滴定。引物终浓度为200 nM时能有效地进行大多数的实验。

引物设计软件程序 (如OligoPerfect™ 设计工具和Primer Express®软件) 及序列分析软件(如Vector NTI®软件) 可自动评估目的序列，并根据上述标准设计序列引物。

使用引物设计软件至少可以确保引物针对目的序列的特异性，且不会形成内部二级结构，并能避免每条引物的 3’端自身或与其它引物之间形成互补杂交。如前所述，在使用DNA 结合染料进行扩增片段检测时，良好的引物设计尤为关键。

基线

实时荧光定量 PCR 反应的基线是指在PCR的最初几个循环中 (一般为第3 至15 个循环)的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声” 。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。应仔细设置基线，以准确确定阈值循环(C_t) (定义如下)。基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。当比较不同的实时荧光定量PCR 反应或实验时，应采用同样的方法确定基线。

实时荧光定量 PCR 反应的基线和阈值

阈值

实时荧光定量 PCR 反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加。设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。实时荧光定量PCR 仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10 倍。但阈值可设置在PCR指数期的任意点。

Ct(阈值循环)

阈值循环(C_t) 是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。C_t值可用于计算起始 DNA 拷贝数，因为C_t 值与起始靶点量呈反比。例如，比较含有不同靶点量的样本的实时荧光定量PCR 结果时，如果第一个样本扩增前起始的靶基因拷贝数是后一个样本的两倍，较之第二个样本，第一个样本可提早一个循环生成C_t。前提是上述两个反应的PCR 的工作效率均为100% (即每个循环后产物量均实现倍增)。模板量越低，出现明显扩增的循环数越高。模板按 10倍稀释，则 C_t 值递减 3.3 个循环。

10 倍连续稀释的扩增曲线

标准曲线

利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率。以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标(x轴)，该浓度对应的C_t 值为纵坐标(y轴)，绘制曲线。从该标准曲线中可以推导出反应性能及各种反应参数 (包括斜率、y 截距和相关系数)相关的信息。标准曲线中所选的浓度应涵盖实验样本的预期靶点浓度范围。

实时荧光定量 PCR 数据的标准曲线示例。标准曲线的 y 轴表示阈值循环 (Ct)，x 轴表示起始 RNA 或 DNA 靶点量。斜率、y-截距和相关系数值可用于提供反应性能相关的信息。